Masson三色染色总踩坑？这些FAQ帮你 “避坑通关”！

Masson三色染色的主要用途是什么？

用于区分组织中的胶原纤维（染蓝色/绿色）、红细胞/肌纤维/细胞质（染红色）和细胞核（染深棕/黑色）。常用于评估纤维化（如肝纤维化、肾小球硬化）、肿瘤间质增生或肌肉病理研究。

经典Masson三色染色的关键试剂是什么，分别有什么作用？

Bounis固定液

用于固定组织形态，效果良好，可以媒染胶原组织，增加染料渗透性和对比度（可使用改良媒染液替代）。

Weigert铁苏木素染色液

用于核染色，含铁离子媒染，使苏木素与核DNA牢固结合，耐酸清洗。

丽春红品红染色液

用于肌纤维染色，小分子酸性染料易渗透致密程度高的肌纤维将其染成红色。

磷钼酸

用于分化胶原纤维的丽春红品红染色效果，并强化胶原纤维疏松结构，促进苯胺蓝结合，分化时间决定红蓝对比度。

苯胺蓝染色液

用于胶原纤维染色，大分子酸性染料易渗透致密程度低的胶原纤维将其染成蓝色。

弱酸溶液

用于丽春红品红和苯胺蓝染色后清洗切片，弱酸性溶液可以起到固色作用，稳定红色与蓝色着色。

G1346-改良Masson染色试剂盒相比于G1340-Masson染色试剂盒的优势是什么？

G1346优势主要体现在2个方面：

1. 使用天青石蓝苏木素，无需现用现配铁苏木素，操作更简单；

2. 使用环保无毒的媒染剂用于胶原纤维预处理，色彩更清晰鲜艳、纤维更加清晰、不易出现过染等。

两款试剂盒均适用于组织的石蜡切片、冰冻切片等染色，且染色稳定、色彩鲜艳。

G1340染色-小鼠肾石蜡切片

G1346染色-小鼠肾石蜡切片

G1340-Masson三色染色结束后整张片子整体颜色偏紫红、胶原纤维蓝色着色不清晰是什么原因？如何进行调整？

原因分析1:

苯胺蓝染色时间短、染色效果不够，从而使红色成为主导色，导致切片整体偏紫红。

调整意见:

可以尝试增加苯胺蓝染色时间，每次以30s为递增单位或者在磷钼酸分化后，快速用蒸馏水清洗3-5s，然后再进行苯胺蓝染色。

原因分析2:

磷钼酸分化不足导致胶原纤维有残留丽春红品红着色，苯胺蓝后续染色效果不佳。

调整意见:

可以尝试增加磷钼酸分化时间至2-3min。

G1340-Masson三色染色结束后整张片子整体颜色偏蓝紫、肌纤维红色着色不鲜艳是什么原因？如何进行调整？

原因分析1:

苯胺蓝染色时间长、染色效果过度，从而使蓝色成为主导色，导致切片整体偏蓝。

调整意见:

可以尝试增加丽春红品红染色时间，同时减少苯胺蓝染色时间（先以2min为基础进行染色，然后根据结果再调整时间）。

原因分析2:

磷钼酸分化过度导致肌纤维红色着色不牢，再进行苯胺蓝染色后被遮盖。

调整意见:

可以尝试减少磷钼酸分化时间至0.5-1min。

染色结果不能及时封片应该如何保存？封片后可以保存多久？

如染色后不能及时封片，可以先将切片置于弱酸溶液里暂时保存几个小时（若观察到有明显颜色溶出现象，需要及时拿出，然后梯度乙醇快速脱水封片），中性树胶封片后的样本一般可以保存至少6个月，但还是建议等树胶凝结干燥之后及时拍照留存结果，防止长期保存过程中盖玻片污染从而影响后续观察。

该试剂盒用于冰冻切片染色时有哪些注意事项？

1. 由于冰冻切片较比石蜡切片易上色，而且不同组织的染色时间也不同，所以需要调整各步骤的染色/处理时间，对于易上色组织样本，可将每一步的染色时间减半来染色；

2. 在苯胺蓝染色这一步，需要用弱酸溶液将苯胺蓝稀释3-5倍后使用，否则容易出现过染现象；

3. 染色和清洗切片时，操作手法尽量轻柔小心，以免组织脱落或翻起；

4. 冰冻切片较石蜡切片组织厚好几倍，最终呈现的染色结果鲜艳度可能会逊色于石蜡切片为正常现象。

染色背景有杂质或污浊是什么原因？

1. 脱蜡不充分，可能存在残留蜡质，建议增加烤片时间或更换新的二甲-苯试剂或环保组织透明脱蜡液；

2. 试剂存在沉淀，如果不确定是否是沉淀，可以吸取50μL液体置于干净的载玻片上，于显微镜下观察是否有大量悬浮颗粒或不溶性物质，如果是沉淀，但不多，可以使用滤纸或针头滤器过滤除杂后再使用。

石蜡切片染色封片放置几天后出现褪色或颜色明显变浅情况是为什么？如何避免这种现象？

可能由于封片前无水乙醇脱水和二甲-苯透明步骤使用的试剂由于多次使用掺入了一定量的水分，导致红色或蓝色着色被溶解，建议更换新的乙醇和二甲-苯进行处理或者苯胺蓝染色后弱酸清洗这一步骤，及时甩干水分，直接晾干后再用中性树胶封片，不进行脱水透明。

同一个组织的相邻切片同时染色后出现颜色不一情况怎么办？

由于Masson三色染色步骤繁多，如果是采取滴染方式，存在这种情况属于正常现象，由于人为操作误差，在依次处理切片时会有一些细微时间差异导致着色程度有所偏颇。可以通过减少一次性染色处理的切片数量或者采取浸染（缸染或小型直立切片孵育盒）的方式进行染色，尽量确保每一步处理的时间保持一致从而减少批间差异。浸染的试剂如丽春红品红染液和苯胺蓝染液可以回收2-3次使用，但不推荐反复使用。